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    首頁   >    新聞資訊   >   感覺態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化注意事項(xiàng)

    感覺態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化注意事項(xiàng)

    點(diǎn)擊次數(shù):852次  更新時間:2022-08-03
       感覺態(tài)細(xì)胞的制備:
      注①:有化轉(zhuǎn)和電轉(zhuǎn)兩種。
      注②:制備具體步驟因人而異。
      將處于對數(shù)生長期的大腸桿菌(細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期,新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感覺態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。對數(shù)生長前期的細(xì)菌可通過測定培養(yǎng)液的OD600控制,所以要嚴(yán)密監(jiān)測細(xì)菌的OD值)置于經(jīng)低溫預(yù)處理的低滲CaCl2溶液(CaCl2和水需是較高純度的)中,在低滲CaCl2溶液中,細(xì)胞會膨脹,同時Ca2+還會使磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu),促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來,離開所在區(qū)域,細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化,極易與外源DNA相粘附并在細(xì)胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基-磷酸鈣復(fù)合物。(整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行,所用器皿高壓滅菌處理)添加其它的二價金屬離子、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理,提高轉(zhuǎn)化率。
     
      感覺態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化注意事項(xiàng):
      連接反應(yīng)產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化之前在70ºC熱滅活15min,連接產(chǎn)物在熱滅活后無需純化可直接使用;
     
      DNA樣本必須是溶解于ddH2O或TEbuffer的純化樣本。電轉(zhuǎn)化樣本中如果存在鹽離子會導(dǎo)致電轉(zhuǎn)過程中的高壓電弧,從而引起細(xì)胞和DNA的損失;
     
      微量離心管和電轉(zhuǎn)杯在使用前必須冰浴;
     
      在使用之前必須在冰上解凍;
     
      為了得到高效的轉(zhuǎn)化效率,請使用試劑盒中的重懸電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞,如果使用TB或其它培養(yǎng)基會降低感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率;
     
      電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞可以在LB或其它常規(guī)培養(yǎng)基上涂板。
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